腫瘤治療過(guò)程中，腫瘤會(huì )出現新的突變，最初能起作用的藥物有可能慢慢失去藥效。因此，針對癌癥患者的治療方案需要不斷地調整。研究人員一直試圖通過(guò)腫瘤細胞體外化療敏感性檢測指導化療藥物的選擇。然而，目前已有的各種腫瘤原代細胞體外藥敏試驗，與體內藥效可能差異巨大，不宜進(jìn)入廣泛的臨床應用。如果在腫瘤治療過(guò)程中，能夠實(shí)時(shí)獲取更接近體內腫瘤特性的體外培養體系，將為化療方案的設計提供更多的臨床依據。
研究發(fā)現患者血液中的循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)保持了它們來(lái)源的實(shí)體腫瘤的部分特性，能被用于追蹤實(shí)體腫瘤的性質(zhì)和變化;加之CTCs的分離獲取對人體是無(wú)創(chuàng )的，這使得用CTCs進(jìn)行實(shí)時(shí)體外培養，篩選藥物敏感性成為可能。
麻省總醫院和哈佛總醫院的研究人員從雌激素受體陽(yáng)性(ER+)的乳腺癌患者血液中，分離了CTCs，然后進(jìn)行細胞培養擴增。多次試驗發(fā)現，CTCs最適宜在添加有EGF和FGF2的無(wú)血清培養基，4% O2下懸浮培養。研究人員成功地從36位ER+的乳腺癌患者血液中分離培養出6個(gè)CTCs細胞系，培養6個(gè)月后 CTCs仍保持著(zhù)初始特征 。研究人員測試了其中5種CTCs細胞系在小鼠體內的成瘤性，其中3種細胞系在3個(gè)月內成瘤。這些CTCs來(lái)源的腫瘤與其匹配的原發(fā)腫瘤具有相同的組織學(xué)和免疫組化特性。培養后的CTCs進(jìn)行基因組測序，結果發(fā)現CTCs與它們起源的實(shí)體腫瘤保持著(zhù)一致的遺傳特性，但又擁有一些新的遺傳突變。如一半的CTCs擁有ESR1(編碼ERα)突變，這與病人接受長(cháng)期芳香酶抑制劑治療的歷史一致。研究人員利用CTCs保持病人的耐藥性的特點(diǎn)，使用CTCs細胞系測試新的靶向藥物的敏感性。他們發(fā)現熱休克蛋白90抑制劑STA9090可以引起ESR1突變的CTCs死亡;STA9090和PI3KCA抑制劑協(xié)同作用，可加速殺死PI3KCA突變的CTCs。通過(guò)分離CTCs進(jìn)行體外培養，也許能夠監控每個(gè)患者不同治療階段對藥物敏感性的變化。如果將之運用于臨床治療過(guò)程中，或許可以幫助患者尋找最適合的治療方案。
腫瘤異質(zhì)性是指腫瘤在生長(cháng)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)多次分裂增殖，其子細胞呈現出分子生物學(xué)或基因方面的改變，從而同一腫瘤組織中的細胞可以分為多個(gè)亞群，不同亞群腫瘤細胞的生長(cháng)速度、侵襲能力、對藥物的敏感性、預后等各方面有較大差異。因此，對腫瘤組織細胞進(jìn)行藥敏檢測得到的結果(包括基因檢測)代表的是優(yōu)勢細胞亞群的藥物敏感性，而不是只占腫瘤細胞總數1%，可轉移到血液中的CTC的藥物敏感性。因此檢測結果指導腫瘤治療導致了目前對腫瘤的治療效果不佳。腫瘤的異質(zhì)性是腫瘤難以徹底治愈的“攔路虎”。
血液中的CTC是后續轉移腫瘤的種子細胞，對CTC的藥物敏感性進(jìn)行檢測，可指導使用對種子細胞殺傷作用最強的藥物，徹底殺死腫瘤細胞，提高治愈率。
化學(xué)治療和靶向治療是目前腫瘤的主要治療手段。近30年來(lái)，雖然某些惡性腫瘤通過(guò)化學(xué)治療或靶向治療有明顯改善，但多數腫瘤療效仍不理想。這與CTC存在個(gè)體差異性，以及多重耐藥性等因素有關(guān)。因此如何選擇有效藥物，進(jìn)行有的放矢的個(gè)體化治療是醫生所關(guān)注的問(wèn)題。
對CTC進(jìn)行藥敏試驗，可篩選出最有效的化療和分子靶向藥物，或者聯(lián)合用藥方案，用來(lái)進(jìn)一步指導個(gè)體化治療。我們以非小細胞肺癌患者50例作為研究對象，25例富集患者外周血中的CTC注射小鼠培養，成瘤之后取腫瘤細胞進(jìn)行體外藥敏試驗，評價(jià)不同化療藥物和靶向藥物的敏感性。另外作為對照組25例醫生按常規的治療方案治療。
隨訪(fǎng)一年記錄臨床療效，對照組的中位PFS分別為7個(gè)月，而CTC藥敏組12個(gè)月內只有6個(gè)病人復發(fā)，中位PFS大于12個(gè)月，因此實(shí)施CTC檢測個(gè)體化治療方案的患者腫瘤復發(fā)率明顯低于常規聯(lián)合化療方案的患者。另外CTC檢測個(gè)體化治療也可以為肝癌、胃癌患者篩選出敏感、有效、個(gè)體化的化療方案，提高病患的生存率，降低腫瘤的復發(fā)風(fēng)險。
Hamilton G研究組首次建立了小細胞肺癌(SCLC)患者的永久性CTC培養。復發(fā)性肺癌患者BHGC7對最初幾周卡鉑/足葉乙甙的治療作出反應，但腫瘤在10個(gè)月后復發(fā)，表現為多發(fā)性骨轉移。這個(gè)病人對進(jìn)一步的治療沒(méi)有反應，在腫瘤進(jìn)展后不久死亡。BHGC10 CTC來(lái)源于一個(gè)難治患者的血液樣本，患者接受第二線(xiàn)藥物治療之前。該患者接受了三個(gè)周期的卡鉑/足葉乙甙，但在治療下進(jìn)展明顯表現出對鉑類(lèi)藥物的耐藥性，與我們隨后的體外細胞毒性試驗一致。從兩名患者身上獲得永久性CTC培養物，并檢查其對順鉑、依托泊苷、表阿霉素和拓撲替康的敏感性。在最大可達到峰值血漿濃度約為3μg/ml的范圍內，BHGC10顯示順鉑的IC50值為2.2μg/ml;而B(niǎo)HGC7是化療敏感的。所有的細胞系似乎對依托泊苷敏感，因為該藥物在體內呈現峰值血漿濃度高達20μg/ml，明顯超過(guò)各自所測定的IC50值。CTC線(xiàn)表達典型的小細胞肺癌標志物，顯示緩慢擴散，細胞倍增時(shí)間約為60小時(shí)。兩種CTC培養物對表阿霉素高度敏感，與蒽替卡坦相比，這種蒽環(huán)類(lèi)藥物在摩爾基礎上更敏感。
如下圖。IC50相差幾倍。因此，在同一劑量下，對有些腫瘤患者而言，已經(jīng)是超出身體的承受范圍，對患者而言是損傷作用;而對另一些患者，這種劑量是不足以對腫瘤細胞造成殺傷。不論那種情況，藥物化療是失敗的。由此可見(jiàn)，對抗腫瘤藥物的藥物敏感性檢測是非常有必要的。
腫瘤化療藥敏檢測有體外與體內兩類(lèi)檢測方法。國內外常用的體外藥敏試驗檢測法有MTT法、CD-DST法和ATP-TCA法。國內以往常用MTT法，現已逐漸淘汰;日本現常用CD-DST法;而歐美常用ATP-TCA法。ATP-TCA(三磷腺苷生物發(fā)光法)檢測技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的最先進(jìn)的腫瘤藥敏檢測技術(shù)，美國國立衛生研究院的GOG (Gynecologic Oncology Group)項目組認為ASP-生物發(fā)光體外檢測腫瘤化療敏感性方法是最有發(fā)展前途的一種藥敏試驗方法。該技術(shù)體外檢測結果與體內治療反應間具有高度的一致性，其總的預測準確率在85%以上，陽(yáng)性和陰性預測值、敏感性和特異性均高于其他技術(shù)。
腫瘤藥篩的主要方法
1、單細胞體外培養法
以膠原酶、胰酶或機械法將腫瘤組織分離出單細胞懸液，以單細胞懸液加測試藥物進(jìn)行培養，以觀(guān)察克隆形成、MTT、ATP 熒光值等不同檢測終點(diǎn)，評價(jià)腫瘤細胞對藥物的敏感性，其中最常用的方法是MTT、MTS、ATP 法。該類(lèi)方法檢測方法簡(jiǎn)單、實(shí)驗時(shí)間短，但成功率低、可靠性差。因為原代細胞分離成單細胞后，因不能模擬體內微環(huán)境故不易培養生長(cháng)，大多數細胞會(huì )發(fā)生凋亡。這可能是長(cháng)期以來(lái)臨床醫生未能接受藥敏指導化療的主要原因。
2、CTC檢測
CTCs是從腫瘤病灶脫離并播散到血液中的腫瘤細胞，是惡性腫瘤患者出現術(shù)后復發(fā)和遠處轉移的重要原因，也是導致腫瘤患者死亡的重要因素。近幾年CTCs在腫瘤診斷、監控等方面的臨床表現逐漸嶄露頭角，是目前最具發(fā)展潛力的腫瘤無(wú)創(chuàng )診斷和實(shí)時(shí)療效監測手之一。大量實(shí)驗已經(jīng)證實(shí)CTCs檢測有助于腫瘤的早期診斷、判斷患者預后、評估抗腫瘤藥物的療效及制定個(gè)體化治療方案。目前，CTC可用于提取并體外培養來(lái)進(jìn)行藥物篩選。
3、人腫瘤細胞原代裸鼠移植瘤模型法(PDX模型)
為了模擬體內的環(huán)境，人們將腫瘤組織塊接種于裸鼠的皮下，建立裸鼠移植瘤模型。由于裸鼠因缺乏T淋巴細胞, 異種移植時(shí)排斥反應不明顯, 進(jìn)行人腫瘤移植時(shí)，可保持原有的生物學(xué)特性及對抗癌藥物的敏感性，故實(shí)驗結果可靠性較高。但該方法目前成功率還不高(文獻報告成功率約50%左右)，而且操作復雜、實(shí)驗室要求高、移植瘤生長(cháng)慢、實(shí)驗耗時(shí)長(cháng)、費用昂貴等，因此不適合常規臨床藥敏試驗, 現僅用于新藥測試。
4、膠原凝膠包埋培養法
為了更好地模擬體內微環(huán)境，Kobayashi建立了膠原凝膠包埋培養法(CD-DST法)，該法首先通過(guò)酶消化獲得單細胞成分，再將細胞包埋于膠原凝膠中，構成與體內相似的微環(huán)境進(jìn)行三維培養，之后加入化療藥物共同培養，利用圖像分析系統計算腫瘤細胞體積的變化來(lái)評價(jià)腫瘤對化療藥物的敏感性。該法目前在廣泛地應用，但成功率仍不高，費用貴。
5、微組織塊培養
該法將腫瘤組織以組織塊的形式在膠原上進(jìn)行培養，然后加入化療藥物，觀(guān)察組織塊對化療藥物的敏感性。其特點(diǎn)是保持細胞間接觸，維持組織形態(tài)和功能，更加接近機體實(shí)體瘤內環(huán)境，臨床效果相關(guān)性好，非常適用于臨床應用。該法是目前較理想的實(shí)體瘤藥敏試驗方法，但對于晚期或復發(fā)腫瘤患者(難以拿到腫瘤組織塊標本)則局限性較大。
目前針對腫瘤組織細胞的藥敏檢測主要用于化療，基因檢測主要用于靶向藥物治療，安徽貝銘生物科技有限公司開(kāi)發(fā)的循環(huán)腫瘤細胞藥敏檢測方法(CTC檢測法)能同時(shí)檢測化療藥物和靶向藥物敏感性，將成為抗腫瘤藥物篩選的金標準，有望大幅優(yōu)化現有抗腫瘤藥物的使用，顯著(zhù)延長(cháng)腫瘤患者生存期。
參考文獻
1.YuM, et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 2014 Jul 11;345(6193):216-20.
2. Hamilton G, etal. Second-line therapy for small cell lung cancer: exploring the potential role of circulating tumor cells. Trans Lung Cancer Res 2016: 5(1):71-77.
